Analisi Legionella

L’analisi della Legionella nelle acque segue specifiche Linee Guida ufficiali. Soltanto con i metodi indicati per il campionamento e le giuste precauzioni è possibile analizzare la legionella nel modo più corretto e sicuro.

Analisi Legionella: Linee guida per la prevenzione e il controllo della Legionellosi

Seguono le informazioni più importanti per l’analisi Legionella estratte dalla documentazione ufficiale rilasciata dal Ministero della Salute. 
Per il documento completo vai a Linee Guida Legionella.

L’analisi della Legionella è il primo passo per valutare le condizioni di una struttura soggetta a contaminazione e a rischio di contagio di Legionellosi.

Campionamento di matrici ambientali per l’analisi della Legionella: Misure di sicurezza

Quali misure di Sicurezza vanno rispettate nell’analisi Legionella?

La Legionella è un microrganismo appartenente al gruppo 2 di rischio come indicato nel Titolo X del dal DLgs n. 81 del 9 Aprile 2008 e s.m.i.. Considerando che la modalità di trasmissione dell’infezione è attraverso inalazione di aerosol si deve valutare attentamente qualsiasi fase della prova che lo generi.

I campioni in cui essa può essere presente, devono essere maneggiati da personale esperto operando con appropriati dispositivi di protezione individuale (maschere, guanti, occhiali; vedi caratteristiche nel paragrafo DPI del capitolo ‘Rischio di esposizione professionale’) e in laboratori adeguatamente attrezzati e dotati di cappe Biohazard di classe II con certificazione di conformità alla norma tecnica EN 12469 (D. Lgs 81/2008 e s.m.i., Linee guida recanti indicazioni ai laboratori con attività di diagnosi microbiologica e controllo ambientale della legionellosi G.U. N. 29 del 5 febbraio 2005).

In aggiunta alla protezione individuale l’operatore, durante l’esecuzione della prova, deve prestare la massima attenzione a mantenere le condizioni di sterilità del campione eliminando qualsiasi possibilità di contaminazione con eventuali altri campioni o con l’ambiente.

Il tecnico che preleva i campioni per analizzare la legionella, non deve appartenere a una categoria a rischio (persone che sono sottoposte a trattamento con corticosteroidi, che abbiano affezioni croniche a carico dell’apparato respiratorio, diabetici, ecc.).

È raccomandato che il tecnico/operatore:

• Indossi quando necessario (ad es. in campionamenti in cui non è possibile lo spegnimento di torri di raffreddamento che determinano, nei confronti del campionatore, un’esposizione a rischio) dispositivi di protezione individuale;
• Minimizzi la formazione di aerosol facendo scorrere l’acqua delicatamente dall’erogatore oggetto del campionamento;
• Eviti l’esposizione ad aerosol;
• Ove praticabile e necessario, richiedere la disattivazione delle torri di raffreddamento odei condensatori evaporativi, almeno 20 minuti prima di effettuare il campionamento.

Il presente allegato riporta le modalità per effettuare il campionamento di matrici ambientali di Legionella annullando e sostituendo quanto riportato nelle ‘Linee guida per la prevenzione e il controllo della Legionellosi’ del 2000. 

Tali indicazioni sono il frutto dell’esperienza maturata dal laboratorio nazionale di riferimento per l’analisi della legionella, dai laboratori regionali di riferimento e da altri laboratori di rilevanza scientifica nell’applicazione delle norme delle sopra citate Linee guida e delle norme iso11731- 1 ‘Water quality-detection and enumeration of Legionella’ del 1998 e ‘Water quality- detection and enumeration of Legionella’ parte 2 ‘Direct membrane filtration method for waters with low bacterial counts’ del 2004 e tengono conto delle informative del gruppo di lavoro ISO per l’accorpamento e revisione delle suddette norme.

Le indicazioni, riportate a seguire, valgono sia per un campionamento da eseguirsi ad opera di Ente di Controllo Pubblico, sia per un campionamento di autocontrollo di routine.

La buona riuscita di un’analisi per la ricerca di Legionella dipende da un prelievo corretto, pertanto tale operazione deve essere effettuata o supervisionata da personale esperto opportunamente formato che conosca:

• Il rischio per sé e per gli altri di trasmissione del batterio dai siti potenzialmente contaminati;
• L’ecologia di Legionella;
• I fattori che ne favoriscono la sopravvivenza e la crescita;
• Gli elementi di base del campionamento microbiologico, in particolare il concetto disterilità.

Precauzioni pre-campionamento

Quali precauzioni prendere per le Analisi Legionella?

A questo proposito è importante adottare appropriate precauzioni per eliminare cross-contaminazione tra i siti di campionamento, specialmente quando si raccolgono campioni ad immersione (serbatoi, bacini di raccolta delle torri di raffreddamento).

Ad esempio, cambiare i guanti ogni volta che si effettua un campionamento ad immersione, alternativamente le mani dell’operatore devono essere disinfettate con alcool isopropilico (propanolo) o etanolo al 70% v/v. 

Anche la superficie esterna delle bottiglie non deve essere contaminata. 

Se c’è qualsiasi dubbio in proposito, la bottiglia deve essere eliminata o disinfettata con alcool isopropilico (propanolo) o etanolo al 70% v/v prima dell’uso.

Prima di effettuare il campionamento, è necessario raccogliere (o aggiornare) le seguenti informazioni relative all’impianto idrico od aeraulico oggetto del monitoraggio:

• Schema della rete idrica (qualora esistente);
• Localizzazione della tubazione di alimentazione idrica alla rete;
• Localizzazione degli eventuali serbatoi d’acqua calda e fredda e di tutti i sistemi che possano generare aerosol d’acqua;
• Presenza di linee di distribuzione idrica contraddistinte da stagnazione/scarso ricambio idrico (ad es. camere non utilizzate per tempi superiori ai 7 giorni);
• Vetustà dell’impianto;
• Distribuzione di ciascun impianto idrico a rischio;
• Presenza di sistemi di disinfezione in continuo installati sull’impianto idro-sanitario,(tipo di impianto, caratteristiche del disinfettante, modalità di monitoraggio delle concentrazioni del disinfettante, ecc.);
• Distribuzione di ciascun impianto aeraulico a rischio;
• Registro di manutenzione con tutti gli interventi ordinari e straordinari effettuati sugli impianti.

Qualora il Registro di Controllo fosse ancora da redigere, raccogliere informazioni su eventuali lavori svolti o su interventi di disinfezione effettuati.

Materiale occorrente

Cosa occorre per analizzare la Legionella:

• Borsa sempre pronta con tutte le attrezzature e i materiali necessari e dispositivi di protezione individuale (guanti, maschere, occhiali);
• Borsa isotermica per il trasporto dei campioni;
• Uno schema dove registrare i dettagli del campionamento effettuato (luogo, temperatura, stanza, volume d’acqua prelevato, condizioni particolari del sito, ruggine, calcare, conformità con le leggi vigenti, ecc.; vedere più avanti ‘Schema di campionamento’);
• Bottiglie sterili con capacità minima di 1 L preferibilmente di vetro o polietilene o contenitori simili, contenenti una concentrazione di tiosolfato di sodio pentaidrato (come indicato nella norma UNI EN ISO19458 al punto 4.2.3), quando sappiamo che potrebbe essere stato utilizzato cloro come sistema di disinfezione, altrimenti se il sistema di disinfezione utilizza ioni rame o argento si neutralizza con EDTA (come indicato nella norma UNI EN ISO19458 alla nota del punto 4.2.3);
• Contenitori sterili con capacità (5-10 L) per campionare acqua proveniente dall’acquedotto o acqua sospetta di essere fonte di infezione ma che si trova ad una bassa temperatura;
• Bottiglie sterili (preferibilmente di vetro, polietilene, polipropilene o altra plastica sterile);
• Contenitori in vetro o polietilene sterili per la raccolta di depositi e incrostazioni;
• Buste di plastica sterili per convogliare il flusso della doccia;
• Tamponi sterili ( cotone, poliestere o altro materiale);
• Provette con 2-5 mL di acqua sterile;
• Disinfettante: etanolo al 70% v/v o propanolo al 70% v/v, ipoclorito di sodio al 10% (possibilmente in confezione spray);
• Bisturi sterili;
• Termometro tarato, preferibilmente digitale con sensibilità 0,1 °C;
• Flambatore;
• Pennarelli resistenti all’acqua o etichette;
• Pinze sterili;
• Elastici;
• Forbici;
• Torcia elettrica;
• Macchina fotografica;
• Alcool isopropilico (propanolo) 70%, possibilmente spray.

Campionamento

Come funziona il campionamento per l’Analisi della Legionella

È necessario che i campioni siano univocamente identificati e univocamente correlati a quanto riportato nello schema di registrazione e quindi mostrare sempre un’attenta osservanza alle procedure di registrazione e marcatura dei campioni.

La Legionella sarà ricercata nell’ambiente idrico artificiale (impianti d’acqua destinata al consumo umano, impianti aeraulici, impianti di raffreddamento a torri evaporative/condensatori evaporativi, fontane decorative, idromassaggi, apparecchiature mediche per la respirazione assistita, impianti d’acqua termale e qualunque altro impianto risulti evidenziato dalla valutazione del rischio legionellosi o da osservazioni effettuate sul campo) limitando i prelievi ai punti che maggiormente possono essere critici, sia in base allo schema di ciascun impianto a rischio sia in funzione dei dati epidemiologici.

I campioni sono rappresentati principalmente da:

• Acqua del circuito dell’acqua calda sanitaria e di quello dell’acqua fredda sanitaria, soprattutto qualora, per quest’ultima tipologia d’impianto, la temperatura sia superiore a 20°C;
• depositi (cosiddetti ‘fanghi’) o sedimenti da serbatoi e altri punti di raccolta dell’acqua;
• incrostazioni da tubature e serbatoi;
• biofilm e/o altro materiale attaccato alle superfici interne delle tubazioni, allo sbocco di rubinetti, nei filtri rompigetto, all’interno del diffusore delle docce, da raccogliere utilizzando dei tamponi;
• acqua d’umidificazione degli impianti aeraulici;
• acqua dell’impianto di raffreddamento a torri evaporative/condensatori evaporativi;
• filtri da impianti di climatizzazione;
• aria umidificata (ad es. quella che fuoriesce dalle torri evaporative/condensatori evaporativi;
• vasche idromassaggio, fontane decorative;
• acqua da sistemi per la respirazione assistita, aerosol;
• acqua e altre matrici tipiche di stabilimenti termali.

Analizzare la Legionella negli impianti idrosanitari

Nella rete idrosanitaria, nonostante sia maggiore la probabilità di riscontrare il batterio nell’impianto di distribuzione dell’acqua calda, è necessario effettuare anche il campionamento dell’impianto di distribuzione dell’acqua fredda sanitaria da effettuarsi in relazione agli esiti della valutazione del rischio e negli altri casi indicati nel presente documento (es. verificarsi di un caso).

Il percorso dell’acqua dovrebbe essere monitorato dal suo punto di partenza (punto di alimento idrico della rete, ossia dall’allacciamento all’acquedotto od al punto d’emungimento d’acqua di pozzo) fino ai terminali di utilizzo (erogatori sentinella).

A seguire, si riporta l’elenco dei principali punti di controllo, da utilizzarsi come riferimento per la definizione della più opportuna mappatura analitica della rete idrica oggetto d’indagine:

• Allacciamento all’acquedotto o dal punto d’emungimento d’acqua di pozzo;
• Accumuli acqua fredda destinata al consumo umano, serbatoi/bollitori acqua calda sanitaria (alla base e ad 1/3 dell’altezza, quando possibile);
• Tutti i siti in cui possono essere presenti fenomeni di ristagno, sedimentazione o di incrostazioni significative;
• Utenze poco utilizzate;
• Ricircolo dell’acqua calda sanitaria (anello di distribuzione);
• Erogatori a servizio di bagni e/o docce distali (erogatori sentinella);
• Addolcitori.

Il campionamento dei punti di controllo deve riguardare l’acqua sanitaria sia calda che fredda. Quando questa è ≤ 20 °C il numero dei campioni può essere ridotto.

La definizione di quali e quanti punti di controllo sottoporre a campionamento deve essere motivata dalla valutazione del rischio legionellosi, così come la frequenza d’esecuzione di tali controlli analitici.

Analizzare la Legionella negli impianti di raffreddamento a torri evaporative/condensatori evaporativi

I campioni devono essere prelevati dal bacino (tenendosi lontani dal punto di immissione dell’acqua tramite galleggiante) e/o dal ritorno caldo dalle utenze (torri evaporative). È sufficiente (a meno di risultanze diverse derivanti dalla valutazione del rischio legionellosi) il prelievo di un campione per ciascun impianto di raffreddamento. 

È opportuno, in presenza di eventi epidemici, effettuare anche un campionamento dell’aria che viene espulsa dalle torri /condensatori evaporativi.

Modalità di prelievo 

Acqua Calda

Il volume consigliabile è di almeno 1 litro.

Per la ricerca di Legionella, in condizioni di utilizzo comune (ossia un campione istantaneo per simulare l’eventuale esposizione da parte di un utente), prelevare senza flambare o disinfettare al punto di sbocco e senza far scorrere precedentemente l’acqua e misurare la temperatura.

Per una ricerca di Legionella all’interno dell’impianto (ossia per monitorarne le sue condizioni d’igiene):

• Far scorrere l’acqua per almeno un minuto;
• chiudere il flusso e flambare all’interno e all’esterno dello sbocco, (quando la flambatura è tecnicamente possibile) oppure disinfettare con ipoclorito al 1% o etanolo al 70% lasciando agire il disinfettante almeno per 60 secondi;
• fare scorrere l’acqua ancora per almeno 1 minuto per rimuovere l’eventuale disinfettante;
• misurare la temperatura ponendo il termometro nel flusso d’acqua e aspettando il tempo necessario affinché raggiunga un valore pressoché costante;
• prelevare il campione.

Si suggerisce l’applicazione di questa modalità di campionamento in occasione dell’esecuzione dei monitoraggi microbiologici di autocontrollo di routine.

Acqua Fredda

Per la ricerca di Legionella in condizioni di utilizzo comune prelevare senza flambare o disinfettare al punto di sbocco e senza far scorrere precedentemente l’acqua e misurare la temperatura ponendo il termometro al centro del flusso. Quindi, prelevare il campione.

Per la ricerca di Legionella nell’acqua all’interno dell’impianto di acqua fredda il campione si può prelevare seguendo quanto è stato descritto per l’acqua calda. Se la temperatura dell’acqua nell’impianto è ≤ 20°C il numero di campioni può essere ridotto.

Depositi o sedimenti.

Prelevare dallo scarico oppure dal fondo della raccolta di acqua, una quantità > 5mL dopo aver eliminato l’acqua dall’alto. Raccogliere in recipienti sterili di vetro o altro materiale monouso.

Incrostazioni

Prelevare da tubature e serbatoi, staccando meccanicamente con bisturi sterile il materiale depositatosi all’interno. Raccogliere in recipienti sterili di vetro o altro materiale monouso contenente una piccola quantità (2-5 mL) di soluzione Ringer o Page o acqua sterile.

Biofilm

Il Biofilm nell’analisi Legionella.

Con un tampone sterile raccogliere il materiale depositato sulle superfici interne o esterne del punto terminale (effettuare il prelievo prima di aprire il flusso d’acqua, dopo aver smontato il rompi getto o il diffusore della doccia). 
Conservare il tampone in recipiente di vetro o altro materiale monouso (provetta) con tappo, contenente una piccola quantità (2-5 mL) di soluzione Ringer o Page o acqua sterile

Filtri

Il controllo per l’analisi legionella deve essere eseguito su filtri utilizzati da diverso tempo, e non su quelli lavati o sostituiti di recente. Prelevare il filtro o una porzione di esso se è di grandi dimensioni e conservarlo in un sacchetto di plastica sterile.

Trasporto e conservazione

Come trasportate e conservare al meglio i campioni per Analisi della Legionella?

I campioni prelevati devono essere consegnati subito affinché l’analisi possa essere iniziata preferibilmente entro le 24 ore dal prelievo e trasportati a temperatura ambiente, al riparo dalla luce, avendo cura di separare i campioni di acqua calda da quelli di acqua fredda. 

Trascorse le 24 ore i campioni devono essere conservati necessariamente +5°C ± 3°C e successivamente trasportati in un contenitore in grado di mantenere tale temperatura e consegnati in tempo utile affinché l’analisi venga iniziata il più presto possibile e comunque non oltre i 4 giorni dal prelievo.

Leggi la versione integrale delle linee guida ufficiali per analizzare la legionella con metodi corretti e sicuri del risultato.

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